產(chǎn)品名稱:Human IL-6 ELISA試劑盒
產(chǎn)品型號(hào):SEKH-0013
產(chǎn)品特點(diǎn):Human IL-6 ELISA試劑盒白細(xì)胞介素 6(IL-6)是一種由淋巴、非淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子。人 IL-6 的 cDNA 序列有 212 個(gè) 氨基酸殘基,含兩個(gè)潛在的 N -糖基化位點(diǎn)。
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Human IL-6 ELISA試劑盒
人白細(xì)胞介素6ELISA 試劑盒
產(chǎn)品編號(hào):SEKH-0013
適用于人血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液等樣本
背景介紹:
白細(xì)胞介素 6(IL-6)是一種由淋巴、非淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子。人 IL-6 的 cDNA 序列有 212 個(gè) 氨基酸殘基,含兩個(gè)潛在的 N -糖基化位點(diǎn)。成熟 IL-6 由疏水 N 末端 28 個(gè)氨基酸殘基信號(hào)肽裂解產(chǎn)生,含 184 氨基酸殘基,其中有四個(gè)半胱氨酸殘基,分子量為 21 kDa。IL-6 由多種細(xì)胞產(chǎn)生,對免疫應(yīng)答、急性 期反應(yīng)、造血和神經(jīng)系統(tǒng)有多方面作用。IL-6 的生物學(xué)活性主要包括 6 個(gè)方面:調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)造血 系統(tǒng)、誘導(dǎo)急性期蛋白、調(diào)節(jié)腫瘤生長、調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和其它。
檢測原理:
Solarbio (Solarbio ®) ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。將抗人 IL-6 單克 隆抗體包被在酶標(biāo)板上;分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)稀釋的樣本,標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的人 IL-6 會(huì)與酶標(biāo) 板上的包被抗體充分結(jié)合;洗板后加入生物素化抗人 IL-6 抗體,該抗體會(huì)與板子上包被抗體捕獲的標(biāo)準(zhǔn)品 和樣本中的人 IL-6 發(fā)生特異性結(jié)合;洗板后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素,生物素與鏈 霉親和素會(huì)發(fā)生高強(qiáng)度的非共價(jià)結(jié)合;洗板后加入顯色劑底物 TMB,若反應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的人 IL-6, 則 HRP 會(huì)使無色 TMB 變成不同深淺(正相關(guān))的藍(lán)色物質(zhì),加入終止液后反應(yīng)孔會(huì)變成黃色;后,在 λmax=450 nm(OD=450 nm)處測定反應(yīng)孔樣品吸光度(OD),樣本中的人 IL-6 濃度與 OD 成正比,通過 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和四參數(shù)擬合軟件便可計(jì)算出樣本中人 IL-6 的濃度。
原理圖:
注意事項(xiàng):
1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用,請不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時(shí)應(yīng)保存在 2-8℃冰箱,已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品,請丟棄。
3. 試劑盒使用前請?jiān)谑覝鼗謴?fù) 30 min,且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測,且加入試劑的順序應(yīng)保持一致。
5. 為避免交叉污染,請?jiān)谠囼?yàn)中使用 1 次性試管,槍頭,封板膜(※)及潔凈塑料容器。
6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少,在運(yùn)輸過程中微量液體會(huì)沾到管壁及瓶蓋上,使用前請離心處理(5-10 S 即可),使管壁上的液體集中在管底部,取用時(shí),請用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外,請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個(gè)組分。
8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確,每次檢測均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
安全提示:
試劑盒中的終止液為酸性溶液,操作人員在使用時(shí)請帶上手套并注意防護(hù);在操作過程中也要避免試
劑接觸皮膚和眼睛,如果不慎接觸,請用大量清水清洗;檢測血液樣本及其它體液樣本時(shí),請按國家生物
實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。
自備實(shí)驗(yàn)器材(不提供,可代購)
1. 酶標(biāo)儀(主波長 450nm,參考波長 630nm)
2. 高精度移液器及一次性吸頭:0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3. 洗板機(jī)或洗瓶
4. 37℃孵育箱
5. 雙蒸水,去離子水,量筒等
6. 稀釋用聚丙烯試管
樣本收集及儲(chǔ)存:
1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:
將細(xì)胞培養(yǎng)基移無菌離心管,在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管于-20℃下保存(24 小時(shí)內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲(chǔ)存),避免反復(fù)凍融。
2. 血清樣本:
室溫血液自然凝固 20 min 后,在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于
-20℃下保存(24 小時(shí)內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲(chǔ)存),保存過程中如有沉淀,請?jiān)俅坞x心,避免反復(fù)凍融。
3. 血漿樣本:
將全血收集到含抗血凝劑的管中,根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際要求選擇 EDTA,檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,混合 20 min ,在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存(24小時(shí)內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲(chǔ)存),避免反復(fù)凍融。
※注意:血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本,以免影響檢測結(jié)果;如果樣本中的靶標(biāo)物檢測濃度高
于標(biāo)準(zhǔn)品的高值,請將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測,建議正式實(shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù)。
試劑準(zhǔn)備:
1. 試劑回溫:先在實(shí)驗(yàn)前 30 min 將試劑盒,待測樣本放置于室溫下,濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶,請放入
37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。
2. 配制洗滌液:預(yù)先計(jì)算好稀釋后的洗滌液使用體積,然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液,未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋:加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液(SR1)1ml凍干標(biāo)準(zhǔn)品中,靜置15分鐘待其*溶解后輕 輕混勻(濃度為1000pg/ml),然后在其余七管中各加入500?1?78?1?76L標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液(SR1),按照以下濃度 進(jìn)行2倍稀釋:500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81 pg/ml進(jìn)行稀釋。500pg/ml為標(biāo)準(zhǔn)曲線高點(diǎn) 濃度,標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液(SR1)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零點(diǎn)(0pg/ml)。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液(1000pg/ml) 未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝,并將其貯存在-20~-80℃冰箱,具體如下圖。
4. 生物素化抗體工作液:預(yù)先計(jì)算好試驗(yàn)所需用量,用檢測稀釋液(SR2)將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍
應(yīng)用工作液(稀釋前充分混勻),請?jiān)?0分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。
5. 酶結(jié)合物工作液:按每次試驗(yàn)所需用量配制,用酶結(jié)合物稀釋液(SR3)將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1 倍應(yīng)用工作液(稀釋前離心),請?jiān)?0分鐘內(nèi)使用。
6. 洗滌方法:
自動(dòng)洗板:甩盡酶標(biāo)板孔中液體,在厚迭吸水紙上拍干,注入洗滌液為 300ul/孔,注 與吸出間隔為 30 秒,洗板 5 次。
手工洗板:甩盡酶標(biāo)板孔中液體,在厚迭吸水紙上拍干,用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔,靜止 30 秒后甩 凈酶標(biāo)板孔中液體,在厚迭的吸水紙上拍干,洗板 5 次。
結(jié)果判斷:
1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測,參考波長為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長檢測,請 用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。
2.計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均 OD 值:每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值
3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),吸光度OD值為縱坐標(biāo),用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,樣品中IL-6含量可通過對應(yīng)OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。
4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測,計(jì)算濃度時(shí)再乘以稀釋倍數(shù)。
1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線
本圖僅供參考,應(yīng)以當(dāng)次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算人 IL-6 的樣本含量
2. 靈敏度:
低可檢測人 IL-6 濃度達(dá) 4pg/ml,
20 個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差,計(jì)算相應(yīng)的可檢測濃度。
3. 特異性:
不與人 IL-6 sR、IL-9、IL-10 反應(yīng),小鼠 IL-6、IL-10、IL-11、IL-12 等反應(yīng)。
4. 重復(fù)性:
板內(nèi),板間變異系數(shù)<10%。
5. 回收率:
在選取的健康人血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個(gè)不同濃度水平的人 IL-6,計(jì)算回收率。
6. 線性稀釋:
分別在選取的 4 份健康人血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人 IL-6,在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀 釋,評(píng)估線性。
參考文獻(xiàn):
《iTRAQ‐Based Proteomic Analysis Exploring the Influence of Hypoxia on the Proteome of Dental Pulp Stem Cells under 3D Culture》 作者:Lei Dou Qifang Yan Panpan Liang Pengfei Zhou Yan Zhang Ping Ji 期刊:Proteomics 影響因子:3.106 PMID:29327447
《Some cardiac marker levels and cytokines in diabetic patients》 作者:Esmail S. Kakey and Shahen S. Hussen 期刊:International Conference on Pure and Applied Sciences 影響因子: PMID:
《Effect of blood purification on serum miR-126 and VEGF levels in the process of atherosclerosis in uremic patients under maintenance hemodialysis》 作者:Dong Zhao,Hong Shao 期刊:The Kaohsiung Journal of Medical Sciences 影響因子:1.291 PMID:30041762
《Release of mitochondrial DNA correlates with peak inflammatory cytokines in patients with acute myocardial infarction.》 作者:Chaoyi Qin, Jun Gu, Ruiqi Liu, Fei Xu , Hong Qian, Qian He, Wei Meng 期刊:Anatol J Cardiol 影響因子:1.112 PMID:27721319
Human IL-6 ELISA試劑盒
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