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果膠酶活性檢測(cè)試劑盒

果膠酶活性檢測(cè)試劑盒說明書
可見分光光度法
英文名稱：Pectinase activity assay kit
關(guān)鍵詞：果膠酶|果膠酶活性檢測(cè)|果膠酶活性測(cè)定|果膠酶活性
注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
貨號(hào)：BC2630
規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 40mL×1 瓶，4℃保存。若溶液中有不溶解物質(zhì)，可以 50℃水浴溶解。
試劑二：液體 40mL×1 瓶，4℃避光保存。
標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1 支，10mg 半乳糖醛酸，4℃保存。臨用前加入 0.943mL 蒸餾水，配成 50µmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說明：
果膠酶（pectinase）是分解果膠的酶類，包括原果膠酶，果膠酯酶，多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶四大類，廣泛存在于高等植物果實(shí)和微生物中，是水果加工中重要的酶。
果膠酶水解果膠生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸與 DNS 試劑反應(yīng)生成在 540nm 有特征吸收峰的棕紅色物質(zhì)，測(cè)定 540nm 處吸光值變化可計(jì)算得果膠酶活性。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、1mL 玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：
一、粗酶液提取：
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入1mL 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。
菌類：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 10000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。
液體：直接檢測(cè)。

二、測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng) 540nm，蒸餾水調(diào)零。
2、將 50µmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為 6、5、4、3、2、1 µmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。
3、取 125µL 樣本沸水浴 10min 備用。
4、操作表：(在 1.5mL 離心管中)
對(duì)照管 測(cè)定管 標(biāo)準(zhǔn)管 空白管
試劑一（µL）    500    500    500   500
50℃水浴溫育 5min
標(biāo)準(zhǔn)溶液（µL）   -      -       125    -
樣本（µL）       -     125       -     -
蒸餾水（µL）     -      -        -    125
煮沸樣本（µL）  125     -        -     -
混勻，50℃水浴反應(yīng) 30min，馬上沸水浴 5min，冷卻后 8000g，常溫離心 10min，取上清。
上清液（µL） 500 500 500 500
試劑二（µL） 500 500 500 500
沸水浴 5min，冰浴冷卻終止反應(yīng)，測(cè)定 540nm 處吸光值 A，計(jì)算△A=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管，
△A 標(biāo)準(zhǔn)=A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
三、果膠酶活性計(jì)算
1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
以各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為 x 軸，其對(duì)應(yīng)的△A 標(biāo)準(zhǔn)為 y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程 y=kx+b，
將△A 帶入方程得到 x（µmol/mL）
2、 果膠酶活性的計(jì)算：
（1）按蛋白濃度計(jì)算
酶活定義：在 50℃，pH3.5 條件下，每毫克蛋白每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生 1µmol 半乳糖醛酸為 1 個(gè)
酶活力單位。
果膠酶活性（U/mg prot）=x×V 提取÷（V 提取×Cpr）÷T= 2x÷Cpr。
（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活定義：在 50℃，pH3.5 條件下，每克樣品每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生 1µmol 半乳糖醛酸為 1 個(gè)酶
活力單位。
果膠酶活（U/g 鮮重）= x×V 提取÷W÷T=2x÷W。
（3）按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活定義：在 50℃，pH3.5 條件下，每 104 個(gè)細(xì)胞每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生 1µmol 半乳糖醛酸為 1
個(gè)酶活力單位。
果膠酶活（U/104
cell）= x×V 提取÷T÷細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）=2x÷細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）。
（4）按液體體積計(jì)算
酶活定義：在 50℃，pH3.5 條件下，每 mL 樣本每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生 1µmol 半乳糖醛酸為 1 個(gè)
酶活力單位。
果膠酶活（U/mL）= x×V 樣÷V 樣÷T= 2x。
V 提?。禾崛∫后w積，1mL； V 樣：加入的樣品體積，0.125mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；
W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間：0.5h。
注意事項(xiàng)：
1、 A 大于 1.5 時(shí)，建議將樣品用提取液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。
2、 植物果實(shí)組織建議將樣本稀釋 10 倍或 20 倍后再測(cè)定。

相關(guān)文獻(xiàn)：
《Transcription factor VmSeb1 is required for the growth, development, and virulence in Valsa mali》 作者:Yuxing Wu,Liangsheng Xu,Zhiyuan Yin,Hao Feng,Lili Huang 期刊:Microbial Pathogenesis 影響因子:2.332 PMID:29959044
《Two members of the velvet family, VmVeA and VmVelB, affect conidiation, virulence and pectinase expression in Valsa mali》 作者:Yuxing Wu , Liangsheng Xu , Zhiyuan Yin , Qingqing Dai , Xiaoning Gao,  Hao Feng , Ralf T. Voegele , Lili Huang 期刊:Molecular Plant Pathology 影響因子:4.379 PMID:29127722